Studie zum Zelleintritt von Viren

Nutzerbericht

Um die entscheidende Phase bei Virusinfektionen besser verstehen zu können kombinieren Forscher die Möglichkeiten der Konfokal- und Rasterkraftmikroskopie

Viren können sich nicht selbst replizieren. Zur Replikation und Reproduktion benötigen sie den intrazellulären Stoffwechsel einer Wirtszelle. Eine der Herausforderungen, die erfolgreiche Viren gemeistert haben, ist die Ausbildung komplexer, mehrstufiger Mechanismen zur Bindung an die Oberfläche der Wirtszelle, um anschließend in die Zelle einzudringen.

Prof. Dr. David Alsteens, wissenschaftlicher Mitarbeiter des FNRS
Prof. Dr. David Alsteens, wissenschaftlicher Mitarbeiter des FNRS

Prof. David Alsteens und seine Arbeitsgruppe am Louvain Institute of Biomolecular Science and Technology haben zusammen mit Kollegen der Universität Pittsburgh vor kurzem in der Zeitschrift Nature Communications eine Forschungsarbeit veröffentlicht, die sich mit der Bindung eines Virustyp an die Zelloberfläche befasst. Ihre Forschungsarbeit ist insofern von besonderem Interesse, da sie dies mithilfe einer Kombination aus Konfokal- und Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM) zum ersten Mal in lebenden Zellen untersuchen konnten.

Prof. Alsteens war so freundlich, uns einige Fragen zur Nutzung der Konfokal- und Rasterkraftmikroskopie sowie zu seiner Forschungstätigkeit im Allgemeinen zu beantworten.

Bitte erläutern Sie kurz die wesentlichen Forschungsziele Ihres Labors. Und wie fügt sich die neue Publikation in Ihren allgemeinen Forschungsschwerpunkt ein?

Die Aufgabe des NanoBiophysics Lab besteht darin, die komplexen biologischen Prozesse besser zu verstehen, die auf der Zelloberfläche unter den jeweiligen physiologischen Bedingungen ablaufen. Aus diesem Grund kombinieren wir AFM und LSM, um Moleküle, Rezeptoren und Zellen zu lokalisieren und gleichzeitig ihre nanomechanischen Eigenschaften zu erfassen. Das erlaubt uns, die biophysikalischen Interaktionen zwischen der AFM-Sonde und der biologischen Probe abzubilden. Wir arbeiten bereits seit mehreren Jahren an Kraft-Abstandsmessungen mit einem AFM, um eine Vielzahl biologischer Proben auf molekularer und zellulärer Ebene zu untersuchen. So können wir besser verstehen, wie biologische Prozesse durch Wechselwirkungen zwischen Einzelmolekülen beeinflusst werden.

Zu den wichtigsten Anwendungen meines Labors gehören unter anderem die Abbildung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit Quantifizierung der freien Bindungsenergie der Liganden sowie die Untersuchung der ersten Phase beim Eintritt von Viren in tierische Zellen (Reovirus, Rotavirus, Herpesvirus, Ebola-Virus-ähnliche Partikel). Unser Schwerpunkt liegt auf dem Verständnis der Dynamik der Interaktionen an der Oberfläche lebender Zellen.

Alsteens Team vor ihrem Konfokal-AFM-Equipment
Alsteens Team vor ihrem Konfokal-AFM-Equipment

Unsere jüngste Publikation passt perfekt zu den Forschungsschwerpunkten meines Labors. Seit meinem Postdoc-Aufenthalt an der ETH Zürich haben wir die Verbindung eines Bio-AFMs der neuesten Generation mit einem hochauflösenden optischen Mikroskop weiterentwickelt. Ziel ist es, eine neue Methodik in der Biophysik und Virologie zu entwickeln, mit der der Eintritt eines Virus mit hoher Auflösung und direkt an der lebenden Zelle untersucht werden kann. Auf diese Weise möchten wir quantitative Daten über die molekularen Prozesse erhalten, die der ersten Phase einer Zellinfektion zugrunde liegen.

In unserer jüngsten Forschungsarbeit kombinieren wir ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) und ein Rasterkraftmikroskop der jeweils neuesten Generation, um die ersten Schritte beim Eintritt eines einzelnen Virus in eine Zelle zu beobachten. Dabei ist es uns gelungen, diese Schritte quantitativ zu beschreiben und die kinetischen und energetischen Parameter der Virus-Rezeptor-Interaktionen bereitzustellen.

Könnten Sie in einfachen Worten erklären, wie ihre Kombination von Konfokal- und AFM-Technologien zu den Ergebnissen dieser Studie beigetragen hat?

Abbildung 1: Konfokales Mikroskopiebild einer AFM-Spitze, die ein einzelnes Virus (grüner Punkt) auf einer Schicht von CHO-Zellen trägt.
Abbildung 1: Konfokales Mikroskopiebild einer AFM-Spitze, die ein einzelnes Virus (grüner Punkt) auf einer Schicht von CHO-Zellen trägt.

Wir haben ein Rasterkraftmikroskop an ein Konfokalmikroskop gekoppelt und untersucht, wie unter Zellkulturbedingungen Reoviren mit den Oberflächen von Säugetierzellen interagieren. Dabei wird eine sehr feine Messspitze mit einem spezifischen Virus funktionalisiert und sanft mit der Zelloberfläche in Kontakt gebracht, sodass sie mit den Komponenten der Zelloberfläche einschließlich Polysacchariden und Rezeptoren interagieren kann (Abbildung 1).

Durch die Kombination mit dem Konfokalmikroskop können wir die Position der AFM-Spitze auf der Zelle in Echtzeit mitverfolgen und mehrere fluoreszenzmarkierte Rezeptoren lokalisieren. Beim Zurückziehen der AFM-Spitze beginnt sich das gebundene Virus von den Rezeptoren abzulösen und wir beobachten dabei, wie stark die Spitze während der Retraktionsbewegung abgelenkt wird. Die Ablenkung ist dabei direkt proportional zu der Kraft, die zwischen dem Virus und den Rezeptoren wirkt. Dies ermöglicht es uns, die Bindungsstärke quantitativ zu bestimmen. Die gemessenen Bindungskräfte werden dann im Detail analysiert, woraus sich Parameter für die kinetischen und energetischen Interaktionen ableiten lassen. Auch die Anzahl der Bindungen, die sich zwischen dem Virus und der Zelle gebildet haben, lassen sich bestimmen (Abbildung 2).

Abbildung 2: Untersuchung der Bindung von Reovirus an CHO-Zellen, die JAM-A exprimieren. (a) Schematische Darstellung des Experiments, in dem die fluoreszenzmarkierten CHO-Zellen (kein JAM-A aufweisend) hervorgehoben sind. (b) Konfokalmikroskopisches Bild, das eine AFM-Spitze auf der Oberfläche von zwei benachbarten Zellen zeigt, die JAM-A-Rezeptoren exprimieren bzw. nicht exprimieren. c) Kraft-Abstand-basiertes AFM-Höhenbild und entsprechende Adhäsionskanäle. Die Adhäsionskarte zeigt, dass sich die meisten Adhäsionskanäle (helle Pixel) auf den Zellen lokalisiert sind, die JAM-A-Rezeptoren exprimieren.
Abbildung 2: Untersuchung der Bindung von Reovirus an CHO-Zellen, die JAM-A exprimieren. (a) Schematische Darstellung des Experiments, in dem die fluoreszenzmarkierten CHO-Zellen (kein JAM-A aufweisend) hervorgehoben sind. (b) Konfokalmikroskopisches Bild, das eine AFM-Spitze auf der Oberfläche von zwei benachbarten Zellen zeigt, die JAM-A-Rezeptoren exprimieren bzw. nicht exprimieren. c) Kraft-Abstand-basiertes AFM-Höhenbild und entsprechende Adhäsionskanäle. Die Adhäsionskarte zeigt, dass sich die meisten Adhäsionskanäle (helle Pixel) auf den Zellen lokalisiert sind, die JAM-A-Rezeptoren exprimieren.

Diese Studie hat uns insgesamt einen großen Durchbruch beim Verständnis des Bindungsmechanismus von Reoviren an Zellen verschafft. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Bindung des Reovirus an die Zelloberfläche in der frühen Phase durch Glykane reguliert wird, die bereits als Bindungsfaktoren bekannt waren (Sialinsäure bei Reoviren). Bisher wurden diese Interaktionen oft vernachlässigt und als unspezifisch angesehen, in der Annahme, dass deren Aufgabe lediglich darin besteht, das Virus an der Zelloberfläche zu konzentrieren. Die Verbindungen sind jedoch viel mehr als „einfache Bindungen“ oder „unspezifische Schritte“, wie bisher angenommen. Unsere Studie zeigt ein physiologisch relevantes Zusammenspiel zwischen den Bindungsfaktoren (α-gebundene Sialinsäureglykane [α-SA]) und dem spezifischen Einschleusungsrezeptor (Junctional Adhesion Molecule A [JAM-A]). Unsere in vitro Experimente und Experimente auf zellulärer Ebene haben einen kooperativen Effekt erkennen lassen. Die Bindung von α-SA an das virale Glykoprotein, das mit geringer Affinität gebunden ist, ist das erste Bindungsereignis und löst zusätzlich eine Konformationsänderung im viralen Glykoprotein aus. Das Glykoprotein nimmt eine ausgedehntere Konformation ein, wodurch seine spezifischen Interaktionen mit dem hochaffinen JAM-A-Rezeptor erleichtert werden. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass kurze sialylierte Glykane über eine Konformationsänderung im Glykoprotein eine Verstärkung der Reovirus-Rezeptor-Bindung induzieren. Dies führt zu einer erhöhten Bindungsavidität und letztlich zu einer Infektiosität, die für zukünftige Impfstoffe und onkolytische Behandlungen genutzt werden kann.

Sie erwähnen in Ihrer Publikation, dass diese Erkenntnisse dabei helfen könnten, Reoviren zukünftig onkolytisch einzusetzen. Können Sie dies etwas näher erläutern?

Die derzeitigen Krebsbehandlungen wie Chemotherapie und Radiotherapie, wie auch die zielgerichteten Kinase-Hemmer und monoklonalen Antikörper (mAbs), sind wegen ihrer unzureichenden Wirksamkeit, zellulären Resistenz und Toxizität nur eingeschränkt anwendbar. Die onkolytische Virustherapie bietet einen neuen therapeutischen Ansatz, der das Potenzial hat, die klinischen Ergebnisse durch ein breites Spektrum an krebsbekämpfenden Wirkungen bei minimaler Humantoxizität dramatisch zu verbessern.
Das Reovirus ist einer der vielversprechendsten Kandidaten für die Entwicklung einer neuen Therapieform und wird derzeit in Phase-III-Studien getestet. Das Reovirus zielt selektiv auf transformierte Zellen mit aktivierten Ras-Signalwegen. Die Ras-Gene gehören zu den am häufigsten mutierten Onkogenen bei menschlichen Krebserkrankungen und es wird geschätzt, dass mindestens 30 % aller Tumore beim Menschen ein abweichendes Ras-Signal aufweisen. Indem das Reovirus auf Ras-aktivierte Zellen abzielt, kann es Krebszellen direkt lysieren, die immunsuppressiven Mechanismen des Tumors stören, die multizelluläre Immunüberwachung wiederherstellen und robuste Antitumorreaktionen erzeugen. Klinische Phase-I-Studien zum Reovirus haben Hinweise auf dessen Wirksamkeit gezeigt und es werden derzeit mehrere Phase-II/III-Studien durchgeführt. Die umfassende präklinische Wirksamkeit, die Replikationskompetenz und das niedrige Toxizitätsprofil des Reovirus beim Menschen zeigen, dass es sich um ein vielversprechendes Krebstherapeutikum handelt, welches weiterhin klinisch erprobt werden muss. Obwohl wir die Funktionsweise von Wirt und viralen Determinanten, die der Replikation des Reovirus und der Abtötung transformierter Zellen zugrunde liegen, inzwischen besser verstehen, gibt es noch vieles zu erforschen. Angesichts all dieser Entwicklungen, aber auch hinsichtlich der noch offenen Fragen, bietet unsere Studie einzigartige Möglichkeiten, die Effizienz der Reovirus-Bindung zu beeinflussen und die Entwicklung der Impfstoffinfektiosität und onkolytischer Anwendungen zu steuern.

Erfahren Sie mehr

 

Lesen Sie den vollständigen Artikel „Glycan-mediated enhancement of reovirus receptor binding“ in Nature Communications.

Erfahren Sie mehr über die ZEISS Technologien, die im Rahmen dieser Studie genutzt wurden:

ZEISS Konfokalmikroskop

Inverse Mikroskope von ZEISS, die als AFM-Plattform verwendet werden können

Tags: AFM, Konfokalmikroskopie

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